Pouco se sabe dos primeiros anos de sua vida. Nasceu entre 1505 e 1515 nas proximidades da cidade de Haddington e foi ordenado padre escocês em 1530. Na Universidade de Glasgow estudou muito a literatura de Agostinho e conviveu também com George Wishard, de quem se tornou discípulo. Essas duas influências fizeram dele um protestante em 1545.

Por volta de 1546, já era conhecido como um poderoso pregador protestante. Sua grande ênfase era a de que a Igreja Católica Romana era uma sinagoga de Satanás e que o papa era o anticristo.

Após o martírio de Wishart, Knox chegou à Universidade de St. Andrews com alguns de seus jovens estudantes e, em 1547, se uniu ao grupo de reformadores que passaram a morar no castelo depois do assassinato do Cardeal Beaton. Quando ele foi nomeado para pregar, recusou, mas foi praticamente forçado a aceitar um chamado da congregação do castelo para se tornar o seu ministro. Em questão de meses, no entanto, o castelo ficou sob o cerco de navios franceses na baía de St. Andrews. Knox e outros foram capturados, e ele se tornou um escravo em uma galé pelo próximo um ano e meio.

Em 1549, Knox foi libertado e partiu para a Inglaterra. Ele pastoreou uma congregação em Berwick, mas logo se mudou para Newcastle. Ele se tornou um capelão real durante os dias do rei Eduardo VI. Mudando-se mais para o sul, sua influência cresceu não menos do que sua insistência no que veio a ser conhecido como o princípio regulador do culto puritano: somente o que é comandado na Escritura é deve ser praticado e obedecido na vida da igreja. Paradoxalmente, foi o presbiteriano Knox que influenciou a presença da chamada Rubrica Negra incluída no Livro de Oração Comum, afirmando que se ajoelhar para receber a Comunhão não era um sinal de devoção, mas apenas uma forma conveniente de administração.

A morte de Eduardo em 1553 foi um golpe para a Reforma na Inglaterra, levando à coroação da rainha Maria Tudor, com quem teve fortes atritos. Então, Knox buscou refúgio no continente. Ele passou algum tempo com Calvino em Genebra.

Posteriormente, ele aceitou um pedido para pastorear a congregação de língua inglesa em Frankfurt. Mas lá, surgiram problemas sobre a sua visão para uma igreja que deveria se ajustar absolutamente ao padrão do Novo Testamento.

Em 1555, depois de um novo período em Genebra, Knox retornou à Escócia para fortalecer o trabalho da Reforma. Ele particularmente buscou encorajar os membros da nobreza escocesa, os quais ele temia correrem o risco de um compromisso fácil com Roma.

Knox casou-se com Marjory Bowes e, em 1556, retornou a Genebra, onde pastoreou uma congregação de cerca de duzentos refugiados. No ano seguinte, recebeu um convite urgente para retornar à Escócia.

Em 1558, Maria Tudor morreu e foi sucedida por Elizabeth I. Knox procurou um meio seguro de voltar ao lar passando pela Inglaterra. Apesar de suas longas ausências de sua terra natal, várias coisas o capacitaram a liderar a Reforma ali: seu nome estava associado aos heróis do passado recente, seus sofrimentos autenticavam o seu compromisso, sua ampla experiência o preparou para liderança e seu senso de chamado o fez “não temer a face de homem algum”.

No verão de 1572, Knox era uma sombra de seu eu anterior. Enfraquecido por um golpe, estava além de seus poderes pregar na Igreja de St. Giles, embora ele conseguisse fazê-lo ocasionalmente nas proximidades de Tolbooth. Em novembro, ficou claro que ele não esperava mais desse mundo. Na manhã de 24 de novembro, ele pediu a sua esposa para ler 1 Coríntios 15 para ele, e por volta das cinco horas seu último pedido foi: “Leia onde eu lancei minha primeira âncora”, certamente com fé. Ela leu João 17. Ao final da noite, ele morreu.

O próprio Knox escreveu com profunda gratidão a Deus pelo trabalho que ele viu ser realizado: “No tocante à doutrina ensinada por nossos ministros e… à administração dos sacramentos realizados em nossas Igrejas, somos ousados ​​em afirmar que hoje não existe um reino na face da terra que os tem em maior pureza; sim (devemos falar a verdade, não importa a quem ofendamos), não há… quem os tenha com pureza semelhante”.

Muitas explicações foram feitas para a influência de Knox e da Reforma Escocesa. Sem dúvida, houve muitos fatores em ação na providência de Deus que causaram tal renovação espiritual. Mas a própria convicção de Knox foi esta: “Deus deu o Seu Espírito Santo em grande abundância a homens simples”. Esta é a maior lição da vida de Knox.